• 热线电话:010-56107385

联系方式

地 址:北京市昌平区北清路生命科学园博雅CC -9号楼2层
电 话:010-56107385
传 真:
邮 箱:support@ori-gene.cn

技术资料

您现在的位置:首页 > 技术支持 > 技术资料
lncRNA,大分子,大学问

  lncRNA大量存在于生物体中并具有多种生物学功能。在整个基因组转录产物中,lncRNA所占的比例远远超过编码RNA所占的比例,通过与DNA、RNA、蛋白质的相互作用,在生命活动调控网络中扮演着十分重要的角色。lncRNA目前是遗传学研究的热点之一。目前已有很多具有重要意义的研究成果,给了人们很多思考的空间,也带来的更多的兴趣和研究方向。但是同时呢,因为它的特殊性,也有很多问题摆在人们面前。

1、lncRNA简介

  长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200 nt的RNA分子,不编码蛋白,位于细胞核或胞质内。lncRNA在基因表达调控、物种进化、胚胎发育、物质代谢以及肿瘤发生等过程中均具有重要作用。

  目前,在人类和动物中关于细胞周期调控、免疫监视和胚胎干细胞多能性等过程发挥作用,以及多种疾病与lncRNA的异常表达或突变相关的研究有很多;关于lncRNA与包括肿瘤在内的疾病相关联的证据可为疾病诊断和治疗提供依据和靶点,对lncRNA功能的深入研究将使目前对细胞的结构网络和调控网络的认识带来革命性的变化,具有不可估量的科学和临床价值。与人类和动物相比,植物lncRNA研究仍处于起步阶段,植物lncRNA的研究可能揭示控制植物生长和分化的未知新机制,lncRNA在植物开花、雄性不育、营养代谢、生物和非生物胁迫等多种生物过程中起着调节因子的作用。

2、根据目前的研究进展,lncRNA具有如下特征:

①lncRNAs通常较长,具有mRNA样结构,经过剪接,具有polyA尾巴与启动子结构,分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式

②与编码基因相比,lncRNA表达量更低

③lncRNAs启动子同样可以结合转录因子

④大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中,都具有明显的时空表达特异性

⑤在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达方式

⑥lncRNA的亚细胞位置呈多样化

⑦序列上保守性较低,但功能上具有一定的保守性;等等。

3、lncRNA分类

  由于非编码RNA在序列、结构以及生物功能上的高度异质性, 目前存在多种分类方法。根据长链非编码RNA基因在基因组上的位置,可将lncRNA分为以下几类:

①基因间区长链非编码RNA,即Large intergenic noncoding RNA,简称lincRNA,产生于两个基因之间的区域

②内含子区长链非编码RNA,即Intronic transcript,内含子lncRNA,来源于次级转录物的内含子区域(有时可能为mRNA前体序列)

③正义链长链非编码RNA,即Sense lncRNA,正义lncRNA,与相同链的另一个蛋白质编码基因的一个或多个外显子相重叠

④反义链长链非编码RNA,即Antisense lncRNA,反义lncRNA,与相反链的另一个蛋白质编码基因的一个或多个外显子相重叠

⑤双向长链非编码RNA,即Bidirectional lncRNA,双向lncRNA,它的转录起始位点与相反链上编码蛋白质基因的转录起始位点非常接近,但转录方向相反

图1  四种不同类型lncRNA图示

4、lncRNA功能

  一般来说,lncRNA可从表观遗传学、转录及转录后三种层面实现对基因表达的调控。

图2 lncRNA不同层面调控功能图示


1)表观遗传学调控-染色质重塑

  lncRNA可通过招募染色质重塑复合物至特定的基因组位点使其发生催化活性。如图2a,HOTAIR21、Xist/RepA和Kcnqot1招募Polycomb complex至HoxD位点,使得X染色体或Kcnq1功能域的组蛋白H3第27位赖氨酸发生3甲基化(me3K27),诱导异染色质形成,从而抑制该区域基因表达。

2)转录调控

  lncRNA可通过多种机制进行转录水平调控,包括自身作为共调节因子、修饰转录因子活性、调节共调节因子的结合和活性等。lncRNA可靶向基因转录过程的不同环节,如转录激活因子、阻遏蛋白,包括RNA聚合酶II、甚至DNA双链在内的转录反应成分来调节基因转录和表达。这些lncRNA可能形成一个包括转录因子的调控网络,在复杂的真核生物中精细调控基因表达。如图2b,lncRNA结合到基因cyclin D1上,招募RNA结合蛋白TLS来调控蛋白CBP和p300的组蛋白乙酰转移酶活性,进而抑制cyclin D1转录;图2c,超保守增强子转录出lncRNA-Evf2,该lncRNA能激活转录因子DLX2,进而调控基因Dlx6转录;图2d,DHFR次要启动子区域转录出的lncRNA与该基因主要启动子区域结合形成三聚体,抑制转录因子TFIID结合,从而使基因DHFR发生沉默。

3)转录后调控

  互补的lncRNA与mRNA形成RNA双链体可掩盖mRNA内部与反式作用因子结合必须的主要元件,可能影响转录后基因表达的任何步骤,包括pre-mRNA的加工、剪接、转运、翻译、降解。图2e中,反义lncRNA与剪接体(splicesome)中锌指同源mRNA Zeb2的5'剪切位点结合,使内含子未被剪切掉,而该内含子序列中保留有内部核糖体进入位点(IRE位点),翻译过程中识别并结合该位点,导致Zeb2基因表达和翻译。


5、lncRNA作用机制

  lncRNA转录一般发生在生物体发育过程中特定的时间和特定的组织中,其转录本有可能作为信号分子、诱饵分子、引导分子、支架分子进一步调控其他基因的表达。目前lncRNA的作用机制还没完全搞清楚,根据lncRNA参与的不同层面的基因调控网络,可将其作用机制分为表观遗传水平调控、转录水平调控及转录后水平调控。

1)表观遗传水平调控

表观遗传水平的调控是真核生物基因表达的转录前水平调节,主要包括染色质的重塑、组蛋白修饰、DNA甲基化(基因组印迹)等,是基因表达调控过程中最重要的环节。具有调控作用的lncRNA通常与DNA、异染色质蛋白、组蛋白修饰酶及转录因子等结合而参与基因转录前水平调节。

2)转录水平调控

转录水平调控是真核基因表达调控的重要环节,是基因表达最主要的调控方式,基因转录过程是受到严密调节的。具有调控作用的lncRNA可通过调控邻近蛋白编码基因的转录、与转录因子相互作用、与DNA形成三螺旋复合物等作用而参与基因或者靶基因的转录水平调控。

3)转录后水平调控

转录后水平调控在基因表达过程中也起重要作用。具有调控作用的lncRNA可通过调控mRNA前体的可变剪接、被剪切成非编码小RNA、调节mRNA稳定性和丰度以及通过ceRNA等作用参与基因转录后水平调控。目前已有许多的lncRNA,比如KPASP1、LINC-MD1、HULC、linc-ROR等都是通过竞争性内源RNA机制调节靶基因的转录水平。

6、lncRNA研究思路-

 

7、lncRNA功能研

  lncRNA较长,承载的信息量多,更容易形成高级结构,因此,lncRNA的功能具有多样化和特异性强的特点。lncRNA的功能非常难研究,对其功能的探索研究采取了多种方式。

1)类似于miRNA,探讨lncRNA功能可用gain/loss of function策略,过表达或沉默lncRNA后观察表型。

    在构建lncRNA表达质粒时,需关注lncRNA是否在蛋白编码基因的启动子区域或3’-UTR区域,勿遗漏重要区段; 也可用siRNA等方法沉默lncRNA,经qRT-PCR或FISH等验证后观察其对疾病相关基因表达和对细胞表型等的影响。实际上,对基因表达或细胞表型的观察也不是任意或无目标的。基于该lncRNA的GO分析等生物信息学手段有助于缩小观察范围。

2)lncRNA功能鉴定和细胞定位的比较热门的一个技术是c-KLAN技术。

  c-KLAN是检测lncRNA介导的各种细胞过程的调控的一种快速、简便和可靠的途径。

 c-KLAN技术即非编码RNA沉默与定位分析(Combined knockdown and localization analysis of noncoding RNAs, c-KLAN)技术。该技术结合了非编码RNAs敲除和定位分析的技术,针对目的lncRNA设计引物,将其逆转录成cDNA,PCR扩增cDNA,一方面对扩增产物进行体外转录, 生成dsRNA,用核糖核酸内切酶Ⅲ酶切dsRNA来制备esiRNA (endoribonuclease-prepared siRNA),用于对lncRNA进行功能缺失研究;另一方面用荧光标记的UTP对扩增产物进行体外转录,以制备正义或反义的FISH探针,用于对lncRNA进行定位分析。

3)通过lncRNA与蛋白质和DNA的相互作用,探讨其功能与作用机制。

  通过互作的蛋白质研究lncRNA的方法如RIP(RNA-immunoprecipatation)技术,包括化学交联RIP、nRIP(native RIP)和CLIP(UV-crosslinked immunoprecipatation)。它们通过特异的抗体结合核蛋白复合物捕获lncRNA,并可与新一代测序技术结合。RIP-Seq和 CLIP-Seq(又称HITS-CLIP)可用于lncRNA筛选和功能研究。

  通过lncRNA与DNA相互作用的检测方法有 ChIRP(Chromatin isolation by RNA purification)、CHART(capture hybridization of RNA target)和ChRIP(chromatin RNA immunoprecipatation)等。由于lncRNA可通过形成二级或三级结构行使功能, 可采用RNase footprinting,Chemical Mapping,in-line Probing和SHAPE(selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension)等技术研究其功能域。

4)生物信息学方法预测lncRNA的功能始终是一个吸引人的研究方向。

  在正确预测的基础上进行功能研究可节省时间,少走弯路。因为lncRNA保守性差,对其功能预测难度不小。有以下几种策略:

①比较基因组学策略:尽管大部分lncRNA一级和二级结构不保守,仍有小部分是保守的,可根据结构保守性可推测功能相似性;

②与编码基因进行共表达分析:这是一种应用较广的策略;lncRNA可通过与蛋白的作用行使功能,可通过它与mRNA的共表达分析预测其功能;适用于基因组水平的分析,数据来源多为微阵列或高通量测序结果;

③通过与miRNA或蛋白的相互作用预测:这种策略只对部分lncRNA适用;通过miRNA推测lncRNA的功能,比如miRcode算法(http://www.mircode.org/mircode/);通过评估其潜在的互作蛋白推测其功能,比如在线算法catRAPID(http://big.crg.cat/gene_function_and_evolution/services/catrapid),该算法可用于预测RNA与蛋白质的相互作用,根据RNA和蛋白质的物理化学性质如二级结构、氢键和范德华力等来评估它们之间相互作用的倾向;

④ ceRNA调控网络:通过研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之间的调控网络预测lncRNA的功能。

相关的miRNA-lncRNA,protein-lncRNA,ceRNA调控网络资源包括

(1)starBase平台(http://starbase.sysu.edu.cn/mirLncRNA.php):构建了最全面的CLIP-Seq实验支持的miRNA和lncRNA, Protein(RNA结合蛋白)和lncRNA (包括了lncRNA,pseudogene,circRNA)的调控关系网络,构建了ceRNA调控网络和提供了长非编码RNA功能预测工具。

(2)DIANA-LncBase数据库(www.microrna.gr/LncBase)构建了基于单个CLIP-Seq数据和计算机预测的miRNA和lncRNA调控关系。[Nucleic Acids Res. 2013 Jan;41:D239-45.]

3) miRcode(http://www.mircode.org/mircode/):一种可以搜索的界面软件,可用来预测miRNA的靶点,当前的版本覆盖了完整的GENECODE注释的转录组,包括10419条已经注册的lncRNA。

8、存在的问题

  目前,关于lncRNA的研究数据呈爆炸性增长,但仍存在诸多问题:

  ①尚无统一的命名原则;

  ②许多lncRNA的生物学功能尚未阐明;

  ③lncRNA作用机制多样、复杂,不同的lncRNA研究结果之间的借鉴意义不高;

  ④lncRNA数据库不够全;

  ⑤用于lncRNA研究的新技术不多,尤其是系统地研究lncRNA的结构和功能,需要建立更多、更有效的研究方法;

等等。

 

附:lncRNA相关数据库

参考文献:

[1] Iwakiri J, Hamada M, Asai K. Bioinformatics tools for lncRNA research[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 2016, 1859(1): 23-30.

[2] Gallart A P, Pulido A H, Sanseverino W, et al. GREENC: a Wiki-based database of plant lncRNAs[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 44(1):D1161-D1166.

[3] Angrand P O, Vennin C, Le B X, et al. The role of long non-coding RNAs in genome formatting and expression.[J]. Frontiers in Genetics, 2015, 6:165.

[4] Laurent G S, Wahlestedt C, Kapranov P. The Landscape of long noncoding RNA classification[J]. Trends in Genetics, 2015, 31(5): 239-251.

[5] Laurent G S, Wahlestedt C, Kapranov P. The Landscape of long noncoding RNA classification[J]. Trends in Genetics, 2015, 31(5):239–251.

[6] Mercer T R, Dinger M E, Mattick J S. Long non-coding RNAs: insights into functions.[J]. Nature Reviews Genetics, 2009, 10(3):155-9.

[7] Ponting C P, Oliver P L, Reik W. Evolution and Functions of Long Noncoding RNAs[J]. Cell, 2009, 136(4):629-641.

[8] Ponting C P, Oliver P L, Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs[J]. Cell, 2009, 136(4): 629-641.

[9] Wilusz J E, Sunwoo H, Spector D L. Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world[J]. Genes & development, 2009, 23(13): 1494-1504.

[10] 黄小庆, 李丹丹, 吴娟. 植物长链非编码RNA研究进展[J]. 遗传, 2015(4):344-359.


偷拍久久国产视频|大香蕉伊人久草AV|久草在线新免费视频|99久久免费热在线精品